Materiais e reagentes
- Sistema HPLC com reator de derivação pós-coluna e detector de fluorescência
- Coluna de carbamatos (fase reversa C18 ou C8)
- Padrão de Carbofurano
- Solução de hidróxido de sódio (NaOH) para hidrólise pós-coluna
- Solução de o-ftalaldeído (OPA) com 2-mercaptoetanol (ou tiofluor)
- Filtros de seringa de 0,45 µm
Procedimento
- CalibraçãoInjetar padrões de carbofurano em pelo menos 5 níveis e montar a curva de calibração.
- PreparoFiltrar a amostra preservada em filtro de 0,45 µm.
- InjeçãoInjetar diretamente um volume grande da amostra (injeção aquosa direta) no HPLC.
- Hidrólise pós-colunaApós a separação, o efluente da coluna é misturado com NaOH e aquecido (cerca de 95 a 100 °C), liberando metilamina.
- DerivaçãoA metilamina reage com OPA e 2-mercaptoetanol no reator pós-coluna, formando um composto fluorescente.
- DetecçãoLer no detector de fluorescência (excitação cerca de 330 nm, emissão cerca de 465 nm) e quantificar pela curva.
- Controle de qualidadeAnalisar branco de reagente, amostra fortificada e padrão de verificação a cada lote. Diluir amostras acima da faixa da curva.
Cálculo
Curva de calibração y = a × C + b
- y: resposta do instrumento (área ou altura do pico)
- a: inclinação da curva
- b: intercepto da curva
- C: concentração do padrão
Concentração na amostra C = ((y − b) / a) × FD
- C: concentração na amostra (µg/L)
- y: resposta da amostra
- a, b: inclinação e intercepto da curva
- FD: fator de diluição (volume final / volume de amostra; 1 se não diluída)
Coleta e preservação
Coleta: Frasco de vidro âmbar com tampa revestida de PTFE. Preservação: Adicionar tiossulfato de sódio (declorante) e tampão de ácido monocloroacético para pH próximo de 3, pois o carbofurano se degrada em meio alcalino. Refrigerar a ≤ 6 °C, sem congelar, e proteger da luz. Prazo: até 28 dias.
Cuidados e segurança
- Carbofurano é muito tóxico (inibidor da colinesterase). Manusear padrões com luvas, em capela, sem contato com a pele.
- NaOH é corrosivo. Usar luvas e óculos.
- OPA e 2-mercaptoetanol são tóxicos e irritantes. Preparar as soluções em capela.
- Ácido monocloroacético é tóxico e corrosivo.