Materiais e reagentes
- Filtro eletropositivo (ex.: NanoCeram) com porta-filtro, bomba e hidrômetro
- Extrato de carne a 1,5% com glicina, pH 9,5, para eluição
- Ácido clorídrico e hidróxido de sódio para acertar o pH
- Centrífuga refrigerada
- Cultura de células BGM (cultura viral) ou termociclador para RT-qPCR
- Iniciadores e sondas para enterovírus, norovírus, adenovírus e outros alvos
Procedimento
- FiltraçãoPasse um volume grande e medido de água pelo filtro (de 100 L em água bruta a mais de 1.000 L em água tratada).
- EluiçãoSolte os vírus do filtro com extrato de carne em pH 9,5.
- FloculaçãoBaixe o pH do eluato para 3,5, centrifugue e dissolva o sedimento em pouco volume de tampão.
- CulturaInocule o concentrado em células BGM e observe o efeito citopático por até 2 semanas, contando pelo número mais provável (NMP).
- MolecularOu extraia o RNA e o DNA e quantifique por RT-qPCR, que é mais rápido mas não diz se o vírus está vivo.
- ControleUse controles positivo, negativo e de inibição em cada lote.
Cálculo
Concentração Vírus por litro = C × (Vc / Vt) / Va
- C: resultado na porção analisada (NMP ou cópias genômicas)
- Vc: volume final do concentrado (mL)
- Vt: volume do concentrado analisado (mL)
- Va: volume de água filtrado (L)
Coleta e preservação
A coleta é a própria filtração, feita no local com hidrômetro. Envie o filtro refrigerado entre 1 e 10 °C, sem congelar, e faça a eluição em até 72 horas.
Cuidados e segurança
- Trabalho com vírus requer laboratório de nível de biossegurança 2 (BSL-2) ou superior.
- Separe as áreas de extração, preparo de reação e amplificação para evitar contaminação no PCR.