Materiais e reagentes
- Placas com meio de cultura (Plate Count Agar, R2A Agar)
- Água de diluição tamponada estéril
- Pipetas estéreis
- Banho-maria a 44 a 46 °C para manter o meio fundido
- Estufa de incubação
- Contador de colônias
- Autoclave para esterilização
- Kit comercial pronto para contagem de heterotróficas (alternativa)
Procedimento
- DiluiçãoAgitar bem a amostra e preparar diluições decimais em água de diluição tamponada, se necessário.
- Técnica de Pour PlateAdicionar 1 mL da amostra (ou diluição) a uma placa de Petri vazia e despejar cerca de 10 a 12 mL do meio fundido, mantido entre 44 e 46 °C. Misturar com movimentos suaves.
- Técnica de Spread PlateEspalhar 0,1 mL da amostra sobre a superfície de uma placa com meio já solidificado.
- IncubaçãoPCA a 35 °C por 48 h. R2A a 20 a 28 °C por 5 a 7 dias.
- ContagemContar placas com 30 a 300 colônias e expressar o resultado em UFC/mL.
- Controle de qualidadeFazer as placas em duplicata e incluir placas de controle de esterilidade do meio e da água de diluição.
- AlternativaKits comerciais prontos (meio desidratado ou substrato enzimático) servem para triagem e controle rotineiro. Laudo oficial segue o método de referência.
Cálculo
Contagem de heterotróficas UFC/mL = N / (V × d)
- N: número médio de colônias nas placas contáveis
- V: volume plaqueado (mL)
- d: diluição usada (ex.: 0,1 para diluição 1:10; 1 se não diluída)
Coleta e preservação
Coleta: Frasco estéril com agente declorante (tiossulfato de sódio). Preservação: Manter abaixo de 10 °C e iniciar a análise o quanto antes, de preferência em até 8 horas.
Cuidados e segurança
- Tratar amostras e culturas como material potencialmente infeccioso. Autoclavar as placas antes do descarte.
- Autoclave trabalha sob pressão e alta temperatura. Seguir as instruções do fabricante.
- Cuidado com o bico de Bunsen perto de álcool.